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*** CRISPR ***

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*** CRISPR ***

Beitrag  checker am Sa Sep 16, 2017 6:44 pm

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats), die im Erbgut von vielen Bakterien und Archaeen auftreten. Sie dienen einem Mechanismus, dem CRISPR/Cas-System, der Resistenz gegen das Eindringen von fremdem Erbgut durch Viren oder Plasmide verschafft, und sind hierdurch ein Teil des Immunsystem-Äquivalents von vielen Prokaryoten. Dieses System bildet die Grundlage der gentechnischen CRISPR/Cas-Methode zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Organismen.


Typ-I CRISPR-surveillance-complex (Cas, blau) mit gebundener Ziel-DNA (orange)

Entdeckung und Eigenschaften

Die Existenz sich wiederholender DNA-Abschnitte, die heute als CRISPR bekannt sind, wurde bereits 1987 im Bakterienstamm Escherichia coli K12 von Yoshizumi Ishino und Kollegen entdeckt. Sie identifizierten eine sich wiederholende Sequenz von 29 Nucleotiden, die von variablen Regionen mit jeweils 32 Nucleotiden unterbrochen wurden.[1] 1993 wurden ähnliche Regionen auch auf der DNA von Mycobacterium tuberculosis entdeckt und als „Direct Variable Repeats“ (DVR) bezeichnet,[2] 1995 erfolgte die Entdeckung dieser Sequenzen auch bei den Meeresbakterien Haloferax volcanii und Haloferax mediterranei durch den spanischen Mikrobiologen Francisco Mojica, der sie als „Tandem Repeats“ (TREPs) bezeichnete.[3] Die Arbeitsgruppe um Mojica identifizierte weitere Bakterien und Archaea mit entsprechenden Sequenzen und wählte für diese sich gleichenden Wiederholungen eine neue Bezeichnung als „Short Regularly Spaced Repeats“ (SRSR).[4] In der Literatur kamen weitere Namen hinzu, die ebenfalls diese Sequenzen bezeichneten, etwa „spacer interspersed and direct repeats“ (SPIDRs) und „long clustered tandem repeats“ (LCTRs).[5] 2002 wurde dann durch Jansen und Kollegen erstmals der Begriff „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“, kurz CRISPR, verwendet. Es wurde bekannt, dass ähnliche Strukturen im Genom vieler verschiedener Prokaryoten existieren, und es wurde eine Gruppe von Genen entdeckt, die in allen untersuchten Organismen nahe am Genlokus der CRISPR lagen und daher cas-Gene (CRISPR-associated) genannt wurden.[6] Jansen und Kollegen identifizierten vier verschiedene Cas-Core-Sequenzen (Cas1 bis Cas4), bis 2005 wurden durch Haft und Kollegen insgesamt 41 entsprechende Gene und zwei weitere Cas-Core-Sequenzen (Cas5 und Cas6) und insgesamt acht Subtypen von CRISPR/Cas-Systemen beschrieben.[7][5]

Heute ist bekannt, dass das Genom von etwa 45 % der bislang sequenzierten Bakterien und 83 % der Archaeen mindestens eine CRISPR-Struktur beinhaltet.[8] CRISPR haben eine Länge, die zwischen 23 und 47 bp variiert. Die Einzelsequenzen des sich wiederholenden Grundmotives wechseln sich ab mit Spacern, die eine Länge von 21 bis 72 bp haben. Während innerhalb einer CRISPR-Struktur die sich wiederholende Sequenz erhalten bleibt, variiert die Sequenz der CRISPR in verschiedenen Mikroorganismen stark.[9] Die Sequenz von CRISPR repeats ist in der Regel palindromisch, was eine stabile Sekundärstruktur der zugehörigen RNA zur Folge hat.

Die Sequenzen der Spacer-Abschnitte variieren stark, sowohl innerhalb einer CRISPR-Struktur als auch in verschiedenen Prokaryoten. 2005 wurde entdeckt, dass die Spacer-Sequenzen mit Fremd-DNA aus Bakteriophagen und Plasmiden identisch sind.[10][11][12] Dies führte zur Hypothese, dass die Funktion von CRISPR darin besteht, den Organismus gegen Fremd-DNA zu verteidigen.

Pathogene der Art Francisella verwenden das CRISPR-Cas-System zur Immunevasion.[13] Bei Neisseria meningitidis und Campylobacter jejuni ist das System ein Pathogenitätsfaktor mit bisher unbekanntem Mechanismus.[13]
Immunität durch CRISPR

2007 wurde von Barrangou et al. gezeigt, dass Bakterien, die mit Phagen infiziert werden, Teile der Fremd-DNA als Spacer in die CRISPR-Bereiche ihres Genoms integrieren und hierdurch Immunität gegen die Phagen entwickeln können.[14] Zudem zeigten sie, dass Spacer-Sequenzen, die künstlich in die CRISPR-Bereiche von Bakterien eingefügt werden, diese gegen die zugehörigen Phagen resistent machen. Werden die Spacer-Sequenzen wieder herausgeschnitten, ist auch die Resistenz aufgehoben. Es wurde außerdem gezeigt, dass die cas-Gene eine essentielle Rolle bei der Phagenabwehr spielen: Das Inaktivieren einiger cas-Gene (cas1) verhindert trotz vorhandener Spacer die Abwehr von Phagen. Die Aktivität anderer cas-Gene (cas7) ist notwendig zur Integration neuer Spacer in die CRISPR-Sequenz.

Mechanismus


Überblick der drei Phasen des CRISPR/Cas9-Prozesses (nach Doudna & Charpentier 2014)[15]

Trotz großer Fortschritte in den letzten Jahren wird der Mechanismus, durch den das CRISPR/Cas-System Prokaryoten Immunität verschafft, noch nicht genau verstanden. Man geht davon aus [9], dass im Immunisierungsprozess die exogene DNA durch einen Cas-Proteinkomplex erkannt und als neuer Spacer in die CRISPR-Bereiche integriert wird. Wie diese Vorgänge im Detail ablaufen, ist noch unbekannt.

Die Anfangssequenz eines CRISPR-Bereiches agiert höchstwahrscheinlich als Promotor und bewirkt die Transkription des gesamten CRISPR-Bereiches in ein langes RNA-Molekül (pre-crRNA). Dieses wird dann mit Hilfe einer RNase III, Cpf1 oder eines Cas-Komplexes (Cascade) in Einzelteile zerlegt, die jeweils einen Spacer und an den Rändern einen Teil der palindromischen Repeats enthalten.[16] Im Zusammenspiel mit den Cas-Proteinen können die einzelnen RNA-Sequenzen fremde DNA bzw. RNA erkennen und über eine Endonuklease wie Cas9 schneiden und somit den Prokaryoten gezielt Immunisierung gegen diejenigen Phagen verschaffen, deren Genom die Spacer-Sequenz enthält. Dieser Mechanismus weist Parallelen zur RNA-Interferenz bei Eukaryoten auf, es bestehen jedoch auch wesentliche Unterschiede, vor allem in der unterstützenden Protein-Maschinerie.
Auswirkungen

Durch den CRISPR/Cas-Mechanismus können Bakterien Immunität gegen bestimmte Phagen erwerben und die so erworbene Immunität weitervererben, da sie einen virusspezifischen Spacer in ihr Genom integrieren und somit bei der Replikation weitergeben. Aus diesem Grund wurde auch die provokante These geäußert, dass es sich beim CRISPR-Cas-System um den ersten wirklich lamarckistischen Vererbungsmechanismus handele.[17]
Anwendungen
→ Hauptartikel: CRISPR/Cas-Methode

Es gibt mehrere Vorschläge, CRISPR biotechnologisch auszunutzen:[18]

Künstliche Immunisierung gegen Phagen durch Hinzufügen passender Spacer bei industriell wichtigen Bakterien, z. B. in der Milch- oder Weinindustrie,
Knockdown von endogenen Genen durch Transformation mit einem Plasmid, das einen CRISPR-Bereich beinhaltet, mit crRNA, die zu dem stillzulegenden Gen passt,
Multiplex Genome Editing erlaubt das gleichzeitige Mutieren verschiedener Zielsequenzen, was die Herstellungzeit von transgenen Tieren wie Mäusen von bis zu zwei Jahren auf wenige Wochen verkürzt,[19]
Unterscheidung verschiedener Bakterienstämme durch Vergleich der Spacer-Regionen (spoligotyping),
Gentherapie,
Fluoreszenzmarkierung.


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